革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌

      革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。[原理]：革兰氏染色目前有三种观点：等电点学说、化学学说和渗透学说。1．等电点学说，革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4-5）低，加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，致使两类菌的等电点差异扩大，因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。2．化学学说，碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被丙酮酒精脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被丙酮酒精脱色而呈革兰氏染色阴性。3．渗透学说，乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料-碘复合物，呈紫色。阴性菌含粘肽少，细胞壁变化不大，通透性不受影响，菌体内的染料-碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。[试剂]：Crystalviolet(结晶紫)、GramIodine(碘液)、Decolourizer（丙酮酒精）、Safranin（稀释沙黄）[操作]：1．标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm离心10min.，取沉渣涂片染色。2．涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。3．染色方法：（1）.加上Crystalviolet(结晶紫)后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。（2）.加上GramIodine(碘液)后染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。（3）.以Decolourizer（丙酮酒精）脱色约5-10秒，并用自来水冲洗之。（4）.加上Safranin（稀释沙黄）后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。（5）.吸干或在空气中凉干后，置油镜镜检。4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。[报告方式]：革兰氏染色：检出革兰氏阳性球菌；革兰氏阴性球菌检出革兰氏阳性杆菌；革兰氏阴性杆菌[注意事项]：1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。2．玻片通过火焰温度不能太高。3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。[临床意义]：通过革兰氏染色，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，便于临床治疗。[附]1沙黄（番红）SafranineT[C20H19ClN4350.85]红棕色粉末；碱基性染料。在水中溶解，在乙醇中易溶。2碘液配制：0.01mol/l碘液——称取1.3g碘，置于50mol烧杯中，加入2.5g碘化钾及25毫升蒸馏水，不断搅拌之，使其溶解均匀。再加0.2mol浓盐酸(体积质量1.19g/cm3)，再加蒸馏水稀释到1000mol。溶液应贮藏在棕色试剂瓶中，储于低温暗橱内。有效期为一个月左右革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存於肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特徵为有一层outmember与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主