许多研究表明,自然环境中很多物理、化学和生物因素都可以使癌基因激活,而这些变化又可以在癌症的演进过程中得到发展。上述3种因素所致细胞突变可以探究到DNA分子-基因水平。所有致癌因素最终一定要改变细胞的遗传物质才能发生致癌效应,鼻部恶性肿瘤也不例外。材料与方法一、临床资料、仪器及试剂:共收集鼻腔鼻窦鳞癌24例,男性13例,女性11例,年龄35~70岁,病史1~3年。鼻腔鼻窦良性肿瘤15例(包括鼻腔血管瘤5例、上颌窦囊肿2例及临床称为癌前期病变的鼻内翻性乳头状瘤8例),鼻腔正常组织5例;良性肿瘤组中男性11例,女性9例,年龄18~59岁。所有病变标本均取自术中或组织活检,且经过病理学诊断,正常鼻腔组织取自健康自愿提供者。二、方法:(一)组织DNA的提取:采用蛋白酶K消化,酚/氯仿异戊醇抽提,乙醇沉淀法。100mg新鲜组织,0℃条件下5mL匀浆缓冲液(100mmol/LTrils,10mmol/LEDTA,pH7.4)中制备组织匀浆,然后加入等体积消化缓冲液(20mmol/LNaCl,20mmol/LTrils,20mmol/LEDTA,pH7.4,含200μg蛋白酶K/mL和0.2%SDS),置37℃水浴消化3h,然后加入等体积的水饱和酚的1/2体积氯仿异戊醇(2.4∶1)抽提2次,再用等体积的氯仿异戊醇提取1次,抽水相,无水乙醇沉淀后置于TE液体中。(二)C-mycDNA探针的制备:扩增克隆转化菌,大量制备重组质粒,内切酶消化,凝胶电泳分离DNA片段,纯化后经缺口转化法,用[α-32P]dATP标记。(三)DotblotDNA杂交:参照ConradG杂交法[1],每份标本DNA取3μg,依次以15倍稀释成5个浓度,分别点膜。对照组采用全基因质粒,取1μg依次以15倍稀释成5个浓度点膜,室温风干,80℃烤2h。将已结合DNA的硝酸纤维放入可封口的耐热塑料袋中进行预杂交、杂交、放射自显影和激光扫描。结果B1-B7,C1-C5,D1-D5,E5,E7,F7,G2-G5共24例为鼻腔鼻窦鳞癌的标本,属c-myc高倍扩增组,扩增倍数为10~40倍;A6,A7,C6,C7,E1-E4,E6,F5-F6,G1,G6,G7共15例为鼻腔鼻窦良性肿瘤组,扩增倍数10倍以下。其中8例鼻内翻性乳头状瘤(临床上属癌前期病变)c-myc的扩增倍数为5~10倍。鼻腔血管瘤和上颌窦囊肿的c-myc扩增倍数为5倍以下。D6,F1-F4共5例为鼻腔正常组织的扩增倍数为5倍以下。见图1,2。
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