间接血凝实验的一般原理及一般步骤

      血凝试验（hemagglutinationtest）是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验，在临床检验中应用广泛，以下简述其操作过程。（一）载体红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3天。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融不破碎，在4℃可保存3～6个月，在－20℃可保存一年以上。（二）致敏致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持良好的免疫活性。用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只须在低pH，低离子浓度下，用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺（bidiazotizedbenzidine，BDB）和氯化铬。前者通过共价键，后者通过金属阳离子静电作用使蛋白质与红细胞表面结合而达到致敏的目的。（三）血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1：64，同时设不含标本的稀释液对照孔。在含稀释标本1滴的板孔（或试管）中，加入0.5％致敏红细胞悬液1滴，充分混匀，置室温1～2小时，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集（一）。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱（图13-4），以＋＋凝集的孔为滴度终点。图13-4血凝反应强度示意图－：红细胞沉积于孔底；＋：红细胞沉积于孔底，周围有散在少量凝集；＋＋：红细胞形成层凝集，面积较小，边缘较松散；＋＋＋：红细胞形成片层凝集，面积略多于＋＋；＋＋＋＋：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状三、胶乳凝集试验胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验，所用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8μm大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子，但这种结合牢固性差。也可制备成具有化学活性基团的颗粒，如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等，抗原或抗体以共价键交联在胶乳表面。化学交联一般通过缩合剂碳化二亚胺将胶乳上的羧基与被交联物上的氨基缩合在一起。这种用交联致敏的胶乳试剂性能稳定，保存期长。胶乳凝集试验分试管法与玻片法。试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释，然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结果。玻片法操作简便，一滴受检标本和一滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动2～3min即可观察结果。出现凝集大颗粒的为阳性反应，保持均匀乳液状为阴性反应。胶乳为人工合成的载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏感度不及血凝试验。四、间接凝集反应的作用间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广为应用。（一）抗原的检测反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。间接凝集反应的敏感度虽较沉淀反应高，但低于新发展的各种标记免疫测定。因此在微量抗原测定中其实用性取决于临床的要求。例如测定尿液HGG的胶乳凝集妊娠试验，直接凝集法的敏感度约为300mIU/ml，凝集抑制法的敏感度约为1000mIU/ml，停经35～40天以上的孕妇可测得阳性结果。检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的间接血凝试验敏感度一般在2～5ng/ml，对献血员的筛检已不符合要求。（二）抗体的检测可用于检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体，例如间接血凝试验或明胶颗粒凝集试验用于检测抗人免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O等。也有用于检测自身免疫性疾病的抗体，例如类风湿因子胶乳凝集试验、抗DNA抗体和抗甲状腺球蛋白抗体的间接血凝试验等。