庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。 这类抗生素通过不可逆地结合细菌30S核糖体亚基，干扰蛋白质合成，从而发挥杀菌作用。庆大霉素对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等阴性菌效果显著，对部分革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）也有一定作用，但通常不作为一线用药。
由于氨基糖苷类抗生素具有明显的耳毒性和肾毒性，庆大霉素的临床应用受到严格限制，一般仅用于住院患者的严重感染（如败血症、腹腔感染、复杂尿路感染等），且需通过静脉注射或肌肉注射给药。使用时必须监测血药浓度，避免超过安全范围，同时定期检查肾功能和前庭功能，防止不可逆的听力损伤或肾损伤。
值得注意的是，庆大霉素在酸性环境中（如脓肿或尿液pH较低时）抗菌活性会下降，因此常需与其他抗生素（如β-内酰胺类）联用以增强疗效。此外，细菌易对其产生耐药性，故不适用于轻症感染或预防性用药。目前，庆大霉素在部分地区仍用于农业和水产养殖，但医学界正逐步减少其使用，以延缓耐药性发展。总体而言，它是一种强效但副作用较大的抗生素，需在医生严格指导下使用。
